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5hmC或成為2型糖尿病血管并發(fā)癥臨床監(jiān)控的重要標(biāo)志物

source:TIME:2019-10-01 08:00:00分享到:

2019年10月1日,5-羥甲基化胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)在糖尿病研究領(lǐng)域取得重要進(jìn)展。2型糖尿?。═2D)的血管并發(fā)癥是導(dǎo)致2型糖尿病致殘致死的重要病因,一直缺乏一種無創(chuàng)便捷的臨床途徑實(shí)現(xiàn)血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展監(jiān)測,達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù),以提高T2D病人的整體生活質(zhì)量,減少衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


該研究入組了62例2型糖尿病病人,采用5hmC-Seal技術(shù)對血漿cfDNA中表觀遺傳標(biāo)志物5hmC的分布情況進(jìn)行檢測,分析5hmC標(biāo)志物與2型糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。結(jié)果表明5hmC標(biāo)志物的變化與T2D合并大血管/微血管事件具有相關(guān)性,主要涉及一些與血管生物學(xué)和糖尿?。òㄒ葝u素耐受和炎癥反應(yīng))相關(guān)的基因和信號通路。該研究建立的16個基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測可以準(zhǔn)確區(qū)分有并發(fā)癥和無并發(fā)癥的2型糖尿病病人[實(shí)驗(yàn)組:AUC=0.85;95% CI,0.73-0.96],明顯優(yōu)于傳統(tǒng)臨床變量例如白蛋白尿。除此之外,還建立了13個基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測,可以進(jìn)一步區(qū)分T2D合并單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥[實(shí)驗(yàn)組:AUC=0.84;95% CI,0.68-0.99],同樣明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)臨床變量。該研究得出結(jié)論,5hmC標(biāo)志物反映了T2D病人大血管/微血管并發(fā)癥發(fā)生過程中的表觀遺傳變化,因而5hmC-Seal檢測技術(shù)在監(jiān)測糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生和進(jìn)展方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。


試驗(yàn)設(shè)計(jì)



本研究共納入62例2型糖尿病病人,包括沒有血管并發(fā)癥的病人12例,有單一血管并發(fā)癥的病人34例(24例發(fā)生大血管事件,10例發(fā)生微血管事件),以及有多種血管并發(fā)癥的病人16例。試驗(yàn)收集62例病人血漿,提取cfDNA,利用5hmC-Seal技術(shù)捕獲外周血cfDNA中的5hmC序列,進(jìn)行二代測序,通過生物信息學(xué)分析找出并發(fā)癥組與無并發(fā)癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因,單一并發(fā)癥組和多種并發(fā)癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因。隨后利用回歸模型對差異基因進(jìn)一步篩選、優(yōu)化,彈性網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步篩選,計(jì)算加權(quán)平均分,最后得到一組具有高度靈敏度和特異性的5hmC生物標(biāo)記物,并進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)組中驗(yàn)證,分析其靈敏度和特異性。并將新建立的5hmC標(biāo)志物基因組合的檢測性能與傳統(tǒng)臨床變量進(jìn)行對比分析。最后對相關(guān)基因進(jìn)行了信號通路分析和功能探究。



研究結(jié)果


5hmC修飾水平與血管并發(fā)癥具有相關(guān)性


利用邏輯回歸模型對62例有并發(fā)癥和無并發(fā)癥2型糖尿病病人的5hmC差異水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),有并發(fā)癥2型糖尿病病人的622個差異修飾候選基因(包括上調(diào)和下調(diào)基因)的歸一化平均數(shù)要明顯高于無并發(fā)癥的病人(P<0.001),但是單一并發(fā)癥和多發(fā)并發(fā)癥病人之間沒有顯著差異。

之后將有單一并發(fā)癥或多種并發(fā)癥的50例病人用邏輯回歸模型進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)多種并發(fā)癥的病人的153個差異修飾候選基因(包括上調(diào)和下調(diào)基因)的歸一化平均數(shù)要低于無并發(fā)癥病人(P<0.001)。


5hmC標(biāo)志物可區(qū)分有無并發(fā)癥患者


62例2型糖尿病病人被隨機(jī)分成訓(xùn)練組(n=31)和測試組(n=31)。利用彈性網(wǎng)絡(luò)篩選后發(fā)現(xiàn),16基因-5hmC標(biāo)志物組合檢測可以用于區(qū)分有并發(fā)癥和無并發(fā)癥的2型糖尿病病人。


基于16基因組合模型 (Detection Model 1) 的加權(quán)平均分分析,發(fā)現(xiàn)無并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)在訓(xùn)練集和測試集中都明顯低于有并發(fā)癥的病人。只考慮加權(quán)平均分的話,受試者工作特征曲線(ROC)分析表明將cutoff值設(shè)置成0.5時(shí),在測試組中中的靈敏度為60%,特異性為100%。



5hmC標(biāo)志物可區(qū)分病人是單一并發(fā)癥還是多種并發(fā)癥


50例有并發(fā)癥的2型糖尿病病人被隨機(jī)分成訓(xùn)練組(n=25)和測試組(n=25)。利用彈性網(wǎng)絡(luò)篩選后發(fā)現(xiàn),13基因-5hmC標(biāo)志物組合可以區(qū)分2型糖尿病病人是否發(fā)生單一并發(fā)癥或多種并發(fā)癥。


基于13基因組合模型 (Detection Model 2), 我們計(jì)算了單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥的加權(quán)平均分,發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練集和測試集中單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)都有明顯差異。值得一提的是,有腎病并發(fā)癥和無腎病并發(fā)癥病人的分?jǐn)?shù)也有明顯差異。利用加權(quán)平均分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)的受試者工作特征曲線(ROC)表明,在測試組中當(dāng)將cutoff值設(shè)成0.69時(shí),靈敏度為87.5%,特異性為68.8%。



5hmC標(biāo)志物與傳統(tǒng)臨床變量/危險(xiǎn)因子的對比


我們評估了不同臨床變量/危險(xiǎn)因子用于監(jiān)測血管并發(fā)癥的靈敏度和特異性(見表1)。

總體來說,結(jié)果表明一些臨床變量(如尿液白蛋白、血清ALT、AST、肌酐、GGT、脂蛋白a)雖然具有一定的靈敏度和特異性,但是整體準(zhǔn)確度仍然差強(qiáng)人意,因此臨床需要更加準(zhǔn)確的方法。另外,我們還在訓(xùn)練組中建立5hmC和不同臨床變量的多變量組合模型進(jìn)行評估,該模型加權(quán)平均分的AUC要明顯大于傳統(tǒng)臨床變量的AUC。若將這些臨床變量與加權(quán)平均分進(jìn)行結(jié)合,AUC也將進(jìn)一步提高。因此,該多變量模型表明加權(quán)平均分可作為一個獨(dú)立的指標(biāo)用于監(jiān)測2型糖尿病血管并發(fā)癥。

信號通路分析和功能探究


有并發(fā)癥和無并發(fā)癥病人的135個差異候選基因的功能注釋分析表明,這些基因主要富集在一些經(jīng)典的信號通路。錯誤發(fā)現(xiàn)率相關(guān)P值位于前10%和基因數(shù)目≥3的信號通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介導(dǎo)的信號通路。由IGF1R和IL-10介導(dǎo)的信號通路與胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)相關(guān),在血管生物學(xué)和糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

Reactome相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心表明,泛素編碼基因[泛素B (UBB),泛素C (UBC),泛素A-52亞基核糖體蛋白融合產(chǎn)物1(UBA52)]是候選基因(如SMAD3FOXD2DRAP1MCIDASMLNPIANPTBCC)的重要連接者。在這135個差異候選基因中, 一些基因 (如TNFRSF25,P=0.027, HR=6.25; MLNP=0.0021, HR=20.40; CCL3L1P=0.018, HR=0.44)表現(xiàn)出與糖尿病病程相關(guān)的傾向,表明5hmC和糖尿病血管并發(fā)癥之間可能存在時(shí)間依賴性的相互作用?;诳v向時(shí)間隊(duì)列的大樣本研究,將可進(jìn)一步明確5hmC變化和糖尿病持續(xù)時(shí)間之間的動態(tài)關(guān)聯(lián)。關(guān)于單一并發(fā)癥和多種并發(fā)癥病人的159個候選標(biāo)志基因的功能注釋研究發(fā)現(xiàn),存在細(xì)胞-細(xì)胞連接、膠原蛋白形成、新陳代謝、細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答信號通路的富集,這些信號通路均與細(xì)胞基本功能密切相關(guān)。


研究意義



血管并發(fā)癥是三分之二糖尿病病人的死亡原因,若能及早有效控制血管并發(fā)癥的發(fā)生,將極大地改善糖尿病病人的生存質(zhì)量。該研究建立了一種利用cfDNA進(jìn)行2型糖尿病血管并發(fā)癥監(jiān)測的無創(chuàng)便捷方法,較目前臨床標(biāo)志物能更準(zhǔn)確地監(jiān)控血管并發(fā)癥的發(fā)生,從而提示臨床及早采取應(yīng)對措施,有效控制病情進(jìn)展。



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